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噬菌体空间消杀试验

文章来源:http://www.casxiaodu.com 发布时间:2020-09-05

1 实验准备

菌株和噬菌体:

敏感大肠杆菌TG1、T4噬菌体;

培养基:

LB琼脂培养基(2%琼脂含量)、LB半固体培养基(0.7%琼脂含量)、LB液体培养基。

仪器耗材:

无菌试管、平皿、三角瓶、移液管、恒温水浴锅、离心机、恒温摇床、紫外分光光度计。

 

2 噬菌体培养及分离方法

(1)将大肠杆菌TG1接种5mL LB液体培养基,于37℃摇床培养过夜。大肠杆菌培养条件,温度,摇床转速,培养时间?

(2)将T4噬菌体原液100µL与大肠杆菌TG1悬浮液300µL均匀混合,静置15min使其感染。此步骤是否需要37℃孵育?此步骤意义?

(3)将混合液接种至含100 mL新鲜LB液体培养基的试管中,于37℃摇床培养过夜。

(4)将培养液移入离心管中,10000rpm离心10min,沉淀大肠杆菌。离心机转子容量不够大,最大转子容量只有8*5mL。

(5)将上清液移至新管中,以0.22 µm孔径过滤器(实验室是否备有?)去除残余菌体,即得不含大肠杆菌的噬菌体原液。噬菌体原液呈透明状,无法以肉眼直接判断其增殖效果,故应测定其效价以确定其增殖培养之成效。

(6)噬菌体原液如何保存?

 

3 噬菌体效价测定:

(1)倒平板:将融化后冷却到45℃左右的下层LB固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中,每皿约倾注10mL培养基,平放,待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。

(2)稀释噬菌体:按十倍稀释法,吸取100ul噬菌体,注入一支装有900ul LB液体培养基的无菌离心管中,即为10-1,依次稀释为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

(3)噬菌体与菌液混合:将14只无菌离心管分别标记10-3、10-4、10-5、10-6和对照。分别从10-3、10-4、10-5、10-6噬菌体稀释液中吸取100ul于上述编号的无菌离心管中,每个稀释度平行做三个管,在另外两只对照管中加100ul无菌水,并分别于各管中加入200ul菌悬液,震荡离心管使噬菌体与寄主菌充分混合,37 ℃水浴5min,让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。

(4)接种上层平板:将14只融化并保温于45 ℃水浴的上层LB半固体培养基5ml分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中,迅速搓匀,立即倒入相应编号的底层培养基平板表面,边倒入边摇动平板,使其迅速铺展表面。水平静置,凝固后37℃培养。

(5)观察并计数:观察平板中的噬菌斑,并将结果记录于计算公式:

N=Y/V%×X

(N:效价值,Y:平均噬菌斑数/皿,V:取样量,X:稀释度)

 

4 噬菌体空间消杀实验

(1)实验开始前先开启30 m3舱的温湿度控制和背景净化系统,温度控制在(23±5)℃,湿度控制在(50±10)%,舱内0.3μm以上粒子背景浓度小于1000个/L。

(2)调节气溶胶发生器雾化速度,使每60min约雾化10ml噬菌体原液(微生物气溶胶发生器雾化量18 mL/h)。在体积为30m3生物安全二级试验舱中,将10 mL上述噬菌体原液加入气溶胶发生器(滴度≥105噬菌斑/mL),开启气溶胶发生器,并开启循环风扇与搅拌风扇,持续产生气溶胶20 min,雾化结束后关闭搅拌风扇,继续开搅拌风扇2 min,静置6 min。

雾化的速度、雾化时间以及使用的噬菌体原液的滴度,均需要经过实验探索进行验证并确定。

(3)静置结束后,向涡旋进气空气采样器采样杯中加入15 mL LB液体培养基,用量摸索,开启采样器,采集测试舱中的空气样本500 L,该样品为噬菌体的初始浓度。

(3)静置结束后,使用多孔玻板吸收管与空气采样器进行采样,向多孔玻板吸收管中加入15 mL LB液体培养基,开启空气采样器,采集试验舱中的空气样本500L,该样品为噬菌体的初始浓度。

采样管中使用的LB液体培养基体积需要进行实验摸索;采样的空气样本体积需要实验摸索;空气采样器采样的流速需要实验摸索;此外,还应该进行采样管的串接实验,以验证单管回收率。

(4)开启待测空气净化器,持续作用60 min,作用结束后,按步骤(3)方法采集测试舱空气样本500 L,该样品为试验后的噬菌体终浓度。

同样的,处理后采样的采样体积需要实验摸索。

(5)设置测试噬菌体的自然衰减率,重复上述步骤(1)~(4),区别只是不开启待测空气净化器。

(6)TCID50计算:

10倍倍比稀释上述回收液,将稀释液加入含生长至单层的Vero细胞的96孔细胞培养板上,同时设置正常对照组,加等量培养液。置于37℃、5% CO2的培养箱中孵育2小时后弃去上清液,加入含双抗400 IU/ml 的维持培养液继续孵育3~5天,每天观察细胞生长状况。当接种病毒的Vero细胞出现变圆和缩小等病变现象时,记录产生细胞病变的情况。根据Reed-Muench公式计算半数感染量TCID50。计算样本中病毒滴度和清除率。

 

(7)PFU计算:

操作过程参考前述噬菌体效价测定。

接种大肠杆菌单菌落于5-10 mL LB培养基中,摇床培养至对数中期(OD600 ~0.5);细胞生长时,微波炉融化上层LB培养基,分成3 mL等份于灭菌试管中,每个噬菌体稀释度一管,保存于45℃备用;37℃预温底层LB平板,每个噬菌体稀释度取一个平板备用;用液体LB准备10倍系列稀释的噬菌体;每个稀释度换一新鲜吸头,建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染;当菌体培养物达对数中期,分成200 μL等份于微量离心管中,每个噬菌体稀释度一管;每管加入10 μL不同稀释度的噬菌体,快速震荡混匀,室温温育1-5 min;将感染细胞加入45℃预温的上层LB培养管中,每次一管,快速混匀,立即倾注于37℃预温的底层LB平板上,适当倾斜平板将上层LB均匀铺开;待平板冷却5 min后,倒置于37℃培养过夜;检查平板,计数有约102个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10 μL噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。

 

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